細胞焦亡是由gasdermin（GSDM）家族蛋白介導(dǎo)的程序性細胞死亡，在機體抵御病原感染、清除變異或有害細胞等過程中發(fā)揮作用。作為細胞焦亡的直接執(zhí)行者，GSDM蛋白備受關(guān)注。哺乳動物的GSDM蛋白具有保守的自抑制雙結(jié)構(gòu)域特征，發(fā)揮抑制作用的C端結(jié)構(gòu)域通過與N端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的分子內(nèi)相互作用，將全長蛋白鎖定在非激活態(tài)。GSDM蛋白的激活需要上游專門的蛋白酶特異性切割，釋放N端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域并在細胞膜上寡聚打孔，介導(dǎo)細胞焦亡。GSDM是一類在進化上保守的膜打孔蛋白，存在于多種細菌、真菌、無脊椎動物以及所有的脊椎動物。盡管在細菌和真菌等低等生物中發(fā)現(xiàn)的GSDM蛋白與哺乳動物的GSDM蛋白的序列差異顯著，且其C端的結(jié)構(gòu)元件普遍短小，但均采用典型的自抑制方式維持在非激活態(tài)，需要特定的蛋白酶切割來釋放保守的膜打孔結(jié)構(gòu)域，引起焦亡樣的裂解性細胞死亡。因此，除蛋白酶切割激活以外，GSDM蛋白是否存在其他不依賴酶切的激活機制以及這一機制如何介導(dǎo)GSDM蛋白執(zhí)行細胞焦亡的功能，有待進一步研究。

4月25日，中國科學(xué)院生物物理研究所丁璟珒研究組與北京生命科學(xué)研究所邵峰團隊合作，在《科學(xué)》（Science）上在線發(fā)表了題為Cleavage-independent activation of ancient eukaryotic gasdermins and structural mechanisms的合作研究論文，揭示了兩種來源于低等真核生物的GSDM蛋白通過非蛋白酶切割的新穎方式激活的分子機制。

該研究通過序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，最原始的多細胞生物絲盤蟲的基因組編碼了一個只含有膜打孔結(jié)構(gòu)域的GSDM同源蛋白（TrichoGSDM）。研究通過重組表達和純化鑒定發(fā)現(xiàn)，TrichoGSDM蛋白同時存在單體和二聚體兩種形式。其中，單體蛋白具有在脂質(zhì)體上打孔的活性，而二聚體則不能上膜打孔。進而，研究解析TrichoGSDM二聚體高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，TrichoGSDM二聚體是由兩個單體蛋白通過三對分子間二硫鍵交聯(lián)而成。研究顯示，在體外利用還原劑處理TrichoGSDM二聚體或者突變參與二硫鍵形成的Cys，均可以獲得均一的單體蛋白，并展示出強烈的膜打孔活性，這表明二硫鍵連接的二聚體代表TrichoGSDM蛋白的非激活狀態(tài)，以及二聚體向還原態(tài)的單體轉(zhuǎn)換可能是TrichoGSDM蛋白潛在的激活機制。細胞質(zhì)中的谷胱甘肽（GSH）和硫氧還蛋白（TRX）是兩種抗氧化系統(tǒng)，可以清除胞質(zhì)中有害的活性氧或者蛋白質(zhì)錯誤氧化形成的二硫鍵，并維持胞質(zhì)的還原環(huán)境。進一步，該研究利用胞質(zhì)生理濃度的GSH或絲盤蟲的TRX蛋白處理TrichoGSDM二聚體，可將二聚體還原、釋放單體的膜打孔活性，在細菌中誘導(dǎo)表達TrichoGSDM具有和哺乳動物GSDM蛋白N端結(jié)構(gòu)域相似的抑菌活性，說明細菌胞質(zhì)的還原環(huán)境利于TrichoGSDM維持在活化的單體狀態(tài)，通過在細菌膜上打孔抑制細菌生長。進而，研究解析了TrichoGSDM在脂質(zhì)體膜上形成的分子孔道高分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了TrichoGSDM由44個單體形成了目前已知的真核生物最大的GSDM孔道。研究通過結(jié)構(gòu)分析揭示了TrichoGSDM識別酸性磷脂、發(fā)生構(gòu)象變化并寡聚組裝成孔的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。上述研究闡明了TrichoGSDM從分子間二硫鍵介導(dǎo)的二聚體自抑制狀態(tài)，通過還原二硫鍵活化成具有打孔活性的單體狀態(tài)，并進一步在膜上寡聚打孔介導(dǎo)細胞死亡的分子機制。這種新穎的激活機制首次在GSDM蛋白中發(fā)現(xiàn)。

TrichoGSDM的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了科研人員繼續(xù)探尋只含有膜打孔結(jié)構(gòu)域的GSDM蛋白的興趣。研究在絲狀真菌粗糙脈孢菌中發(fā)現(xiàn)的融合致死基因rcd-1，在不同菌株中的等位基因可編碼RCD-1-1和RCD-1-2兩種同源蛋白。當不同菌株發(fā)生細胞融合時，兩種RCD-1蛋白介導(dǎo)同種異體識別引發(fā)的細胞死亡。研究通過解析RCD-1-1和RCD-1-2的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩種RCD-1蛋白與哺乳動物GSDM的膜打孔結(jié)構(gòu)域具有相似的結(jié)構(gòu)特征，但二者缺少發(fā)揮自抑制功能的結(jié)構(gòu)元件。單獨的RCD-1-1或RCD-1-2在溶液中呈現(xiàn)單體狀態(tài)，通過識別酸性磷脂結(jié)合在脂質(zhì)體膜上卻無法寡聚打孔，因而無細胞毒性。然而，兩種RCD-1蛋白在大腸桿菌、釀酒酵母或HeLa細胞等多種細胞系統(tǒng)中共表達時，會引發(fā)強烈的裂解性細胞死亡。研究通過解析共孵育的RCD-1-1和RCD-1-2蛋白在脂質(zhì)體膜上形成的分子孔道冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白通過交替排布的異源寡聚組裝方式形成已知的最小GSDM孔道。研究分析RCD-1分子孔道中兩種蛋白的作用方式發(fā)現(xiàn)，每一個RCD-1-1分子均與兩側(cè)相鄰的RCD-1-2分子相互作用，但兩側(cè)的互作方式不等效。也就是說，擁有更強分子間極性作用的一側(cè)主導(dǎo)RCD-1異源二聚體的形成，而另一側(cè)的分子間相互作用驅(qū)動以異源二聚體為單元進一步寡聚成孔。將RCD-1-1和RCD-1-2蛋白與脂質(zhì)體共孵育，或分別結(jié)合脂質(zhì)體后再進行共孵育，均可以通過兩種蛋白的分子間識別激活在脂質(zhì)體膜上的打孔活性，而將異源二聚體識別界面的關(guān)鍵殘基突變，在分別表達兩種蛋白的不同交配型酵母細胞融合或不同粗糙脈孢菌菌株的孢子融合時，均阻斷了RCD-1蛋白的分子間識別，因而不能激活膜打孔活性并引起裂解性細胞死亡。上述工作揭示了具有膜結(jié)合特性的RCD-1蛋白單獨存在時處在未激活的靜息狀態(tài)，細胞融合導(dǎo)致兩種蛋白相遇，通過分子間特異性識別來激活異源二聚體組裝，并進一步在細胞膜上寡聚成孔，執(zhí)行細胞死亡的功能。

上述成果打破了GSDM蛋白需要蛋白酶切割打開自抑制以及激活膜打孔活性的傳統(tǒng)認識，揭示了低等真核生物中兩類只含有膜打孔結(jié)構(gòu)域的GSDM蛋白，分別通過氧化還原調(diào)控或配對的分子間相互作用來釋放膜打孔活性的全新激活機制，拓展了對于GSDM蛋白進化和功能多樣性的機制認知。多種不同的激活機制表明，GSDM蛋白可以響應(yīng)更廣泛的生物學(xué)信號，參與更豐富的生命活動過程。同時，這種不依賴酶切的GSDM蛋白具有被開發(fā)為誘導(dǎo)細胞死亡新型工具的潛力，并有望助力細胞焦亡相關(guān)的基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究。

研究工作得到國家自然科學(xué)基金委員會、科學(xué)技術(shù)部、中國科學(xué)院和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院等的支持。

論文鏈接

低等真核生物絲盤蟲和粗糙脈孢菌編碼只含有膜打孔結(jié)構(gòu)域的GSDM蛋白，通過非蛋白酶切割的新穎方式激活膜打孔活性，執(zhí)行細胞死亡的功能。